Вид Apis mellifera включает более 20 географических вариантов, различающихся по морфологическим и поведенческим признакам. В настоящее время появились мощные научные инструменты, которые позволяют определить их и выяснять эволюционные связи. Эти методы основаны на изучении ДНК.
ДНК любого организма содержит полную информацию, необходимую для его конструирования в ходе индивидуального развития. Эта информация наследуется из поколения в поколение, практически не изменяясь, за исключением случайно возникающих и передающихся потомству мутаций. ДНК содержит информацию о родственных связях и эволюции данного организма. Исследователи считают, что расшифровывая ее можно определить генотип, чего нельзя сделать изучая внешние признаки организма (фенотип).
Молекула ДНК имеет структуру двойной спирали. Если вы возьмете металлическую лестницу и обернете ее вокруг телеграфного столба, а затем удалите его, то получите модель молекулы ДНК. Но самое важное заключается не в скрученности лестницы, а в структуре ее ступеней. Они бывают двух типов: у первого на одном конце находится молекула основания цитозин (Ц), а на другом — основание гуанин (Г); у второго на одном конце находится молекула тимина (Т), а на другом – аденина (А). Оба типа ступеней могут быть расположены по всей длине лестницы таким образом, что на каждой из ее сторон встречается все четыре вида оснований — А, Г, Т, Ц с комплементарными основаниями на противоположной стороне. Информация закодирована в последовательности оснований одной из сторон, тогда как другая сторона является некодирующей. Гены функционируют, переводя последовательность оснований в последовательность аминокислот белковых молекул. Некоторые белки (белки мышц) выполняют структурные функции, но большинство являются ферментами, осуществляющими специфические химические превращения.
Лишь четыре класса ДНК информативны для изучения происхождения и родственных связей медоносных пчел. Это хромосомные и митохондриальные белок-кодирующие ДНК и хромосомные и митохондриальные некодирующие области ДНК. Исследования ДНК пчел, проведенные в Версале Лионелом Гарньером (Lionel Garnier) и в Копенгагене Бо Вест Педерсеном (Bo Vest Pedersen), позволили выяснить происхождение и родственные отношения европейских популяций медоносной пчелы Apis mellifera.
Хромосомная белок-кодирующая ДНК. Варианты, возникающие в результате мутаций в кодирующей последовательности гена, называются аллелями и могут быть обнаружены у потомков, если изменения не коснулись функции кодируемого белка. Их можно сопоставить с вариантами написания одного и того же слова, не изменяющего его смысл. Например, слово гемоглобин — кровяной пигмент млекопитающих можно произнести как «гемоглобин» или же как «хемоглобин». Смысл слова от варианта произношения не изменится. Определение нуклеотидной последовательности хромосомных генов выявляет много аллельных вариантов. Их группируют в четыре неперекрывающихся кластера — А, М, С и О по аналогии с классификацией Руттнера (Ruttner), основанной на общем фенотипе пчел. Этот подход также позволяет оценить генетическое расстояние между кластерами, вычисленное как степень сходства или же различия.
Митохондриальная ДНК. Цитоплазма большинства клеток содержит митохондрии, в которых находятся несколько идентичных копий кольцевой митохондриальной ДНК. Она наследуется только по материнской линии без рекомбинации с отцовской ДНК. Митохондриальная ДНК также подвержена мутациям, они передаются потомству матки и служат материалом для выяснения родственных отношений самок без учета вклада самцов. Митохондриальная хромосома невелика, имеет кольцевую форму и состоит из плотно расположенных генов, разделенных короткими межгенными участками. Две формы цитохромоксидазы COI и СOII разделены сложными повторяющимися последовательностями. Структура повторов специфична для подвидов. У A. m. ligustica повторы Q1, Q2, Q3 с расположенным за ними геном тРНК называются повторами типа I. Повторы типа II — это такая же последовательность с инсерцией Р-элемента между Q-повторами и геном тРНК. Тип III характеризуется дупликацией комплекса Q-повторов и Р-элемента. Тип IV образован тремя Q-повторами. Для типа V характерны четыре Q-повтора, ассоциированные с инсерцией Р-элемента. Восточная пчела A. cerana характеризуется межгенным элементом РА, описанным как тип 0.
Митохондриальная ДНК кодирует гены ферментов, первичная структура (последовательность нуклеотидов) которых является глубоко консервативной, например, как цитохром С. Лишь некоторые незначительные мутации сохраняются естественным отбором. Тем не менее со временем точечные нуклеотидные замены аккумулируются и могут оказаться весьма информативными. Подробное детальное сравнение митохондриальных кодирующих и некодирующих областей позволяет реконструировать родословную для практически всех изучаемых впервые материнских линий. Исследованиями выявлен более высокий генетический полиморфизм северных подвидов медоносной пчелы по сравнению со всеми остальными подвидами, вместе взятыми. Морфометрические и молекулярные данные хорошо коррелируют. Конфликты в классификации обнаружены в основном между расами средиземноморских островов. У них выявлена различная степень интрогрессии африканских пчел.
Хромосомная некодирующая (микросателлитная) ДНК. Этот класс, используемый для ДНК-фингерпринтинга у человека, представляет собой хромосомную некодирующую фракцию микросателлитной ДНК. В ранних исследованиях было принято центрифугировать выделенную ДНК и разделять получаемые фракции. Основную ее часть собирали на дне пробирки, но, как правило, некоторое количество можно было найти и в верхних, более легких фракциях (слоях градиента). Эта ДНК получила название сателлитная ДНК. Она состоит из многократно повторяющихся последовательностей. Те фракции, в которых повторяющиеся единицы очень малы (четыре нуклеотида или короче), получили название микросателлитная ДНК. Число повторов высоко вариабельно, и разные подвиды медоносной пчелы имеют характерные различия, позволяющие проводить их идентификацию независимо от идентификации по митохондриальной ДНК. Такой подход дает информацию как об отцовском, так и о материнском вкладе в популяционную наследственность, его можно использовать для определения степени интрогрессии чужеродного материала в популяционные геномы.
Хромосомный тип, названный «avoidbananaskins» или «avoidba-(na)2-skins», содержит два повтора последовательности «na». В соматических клетках ДНК-полимераза иногда делает ошибку в копировании числа повторов в повторяющихся последовательностях. Это приводит к появлению последовательности avoidbananananaskins, которая образует другой аллель того же самого «гена», содержащего «avoidba» на одном конце и «skins» на другом. Это именно тот тип изменчивости, который мы ищем в микросателлитах.
ПЦР-амплификация. В общем случае в геноме содержится только две копии микросателлитной последовательности. Каждая из них была унаследована от одного из родителей. Для того чтобы изучить их, две копии должны быть амплифицированы миллион раз, что и осуществляется в ходе процесса, называемого полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Процесс осуществляется ферментом, выделенным из бактерий, обитающих в термальных источниках Йеллоустонского национального парка. Особое свойство этого белка заключается в его способности работать при исключительно высоких температурах. В ходе ПЦР-реакции матричную ДНК, выделенную из пчелы, нагревают до 94°С, чтобы вызвать плавление двуцепочной ДНК. Пара праймеров, представляющая собой короткие фрагменты ДНК, идентичные фланкирующим областям микросателлитного повтора (в нашем примере это «avoidba» и «skins»), добавляется к матричной ДНК и отжигается по ее прямой и противоположной цепям. Затем ДНК-полимераза достраивает цепи ДНК, последовательно присоединяя нуклеотиды А, Г, Т и Ц. В конце процесса мы получаем две копии последовательности, ограниченные праймерами, на каждую исходную. Весь цикл затем повторяется с образованием 4, 8, 16, 32 и так далее идентичных копий исходной последовательности. Один цикл ПЦР занимает несколько минут. Таким образом, за несколько часов автоматизированного процесса можно получить миллионы копий. Количество биологического материала, необходимого для ДНК-анализа, очень мало и измеряется в микролитрах. ДНК, содержащаяся в этом количестве, не может быть видимой. Для того чтобы это сделать и манипулировать ею, технологию ПЦР сочетают с гель-электрофорезом.
Гель-электрофорез. Препарат ДНК, полученный из одной пчелы в реакции ПЦР амплификации, помещают в гель и ее фрагменты разделяют в нем под действием электрического тока. В конце электрофореза можно видеть различные микросателлиты в форме полос, расположенных по порядку в зависимости от числа повторов, которые они содержат. ДНК различных подвидов имеет разное число повторов, что позволяет определить происхождение изучаемой хромосомы по характерному размеру микросателлитов. Полученные результаты отражают вклад обоих полов в наблюдаемую изменчивость. Избыток гомозигот, выявляемых микросателлитным анализом, указывает на инбридинг.
Таким образом, анализ хромосомных генов медоносной пчелы выявляет четыре основные группы подвидов, сопоставимые с А, М, С, О группами (по Руттнеру), найденными благодаря результатам морфометрического анализа, но с указанием на гораздо более тесное родство между северо-европейской М-группой и африканской А. Европейские группы С и О менее родственны группе М, чем группа А. Анализ митохондриальных межгенных последовательностей выявляет I, II, III и другие группы в пределах основных и может быть использован для дальнейшей более детальной идентификации. Анализ митохондриальных белок-кодирующих последовательностей позволяет выявить родственные отношения материнских линий и установить степень этого родства. Хромосомная микросателлитная ДНК также позволяет идентифицировать подвиды и выявить акты генетической интрогрессии, осуществленной в недавнем прошлом трутнями других подвидов.
Д.ПРИЧАРД,
президент Международной организации
по сохранению темной европейской пчелы
Великобритания
Перевод И.И.ГОРЯЧЕВОЙ
Адрес редакции журнала "Пчеловодство":
