В последние годы заметно возрос интерес к изучению вирусов пчел. После распространения варроатоза выяснилось, что клещ варроа является переносчиком вирусных инфекций. Некоторые вирусы, считавшиеся безопасными для пчел, в условиях варроатоза стали вызывать массовую гибель пчелиных семей. Впервые заражение пчел вирусом острого паралича через клещей варроа было установлено в 1979 г. [1]. Позднее было доказано, что эти клещи могут быть переносчиками и других вирусов.
Известно, что при одном и том же уровне заражения клещами одни семьи пчел погибают, а другие остаются живыми. Объясняется это тем, что при отсутствии сопутствующих инфекций пчелы могут выдерживать значительную степень заражения клещами — до 15 тыс. клещей на семью пчел. В то же время достаточно 2 тыс. клещей — переносчиков вируса деформации крыла, чтобы семья пчел погибла во время зимовки. Для каждого конкретного вируса или для комбинации вирусов количество клещей в семье, при котором начинается массовая гибель пчел, различно.
В прежние годы для выявления вирусов пчел использовались различные серологические реакции, чаще всего реакция иммунодиффузии (РИД). В основе этой реакции лежит взаимодействие специфических сывороток с антигенами искомого вируса. Недостатком РИД является ее низкая чувствительность. Однако, если экстракт из погибшей пчелы в этой реакции положительно реагирует с определенной сывороткой, можно сказать, что вируса в экстракте очень много и что пчела погибла именно от этого вируса.
В настоящее время зарубежные исследователи для изучения вирусов пчел используют современный, высокочувствительный метод ПЦР (полимеразной цепной реакции), позволяющий обнаруживать вирусы в очень малых концентрациях, когда никаких признаков заболевания у пчел еще нет. Кроме того, этот метод дает возможность выявлять различия между штаммами вирусов на молекулярно-генетическом уровне. В ПЦР вирус обнаруживают с помощью праймеров — небольших участков генома вируса. Эти участки содержат всего 2–3 десятка нуклеотидов — незначительную часть генетической информации вируса, но они должны быть специфичны только для искомого вируса.
С помощью метода ПЦР американские исследователи установили, что в США практически все пчелиные семьи, погибшие от так называемого коллапса в 2006–2007 гг., были инфицированы израильским вирусом острого паралича. Этот же вирус был обнаружен у пчел, закупаемых Соединенными Штатами в Австралии. Для предотвращения дальнейшего распространения вируса на территории США предлагалось запретить импорт австралийских пчел. Несмотря на достоверное совпадение случаев коллапса пчелиных семей с наличием израильского вируса острого паралича, оказалось все не так однозначно.
Дальнейшие исследования образцов хранящихся проб пчел показали, что этот вирус циркулировал на территории США по крайней мере с 2002 г., то есть до начала массового завоза пчел из Австралии. Были выявлены существенные отличия американских штаммов вируса от австралийских на молекулярно-генетическом уровне и показано, что израильский вирус острого паралича имеет три разновидности. Кроме того, было высказано предположение, что эти разновидности, подобно вирусу гриппа, способны к рекомбинации и изменению своей вирулентности [5].
Интенсивные вирусологические исследования пчел с помощью методов молекулярно-генетического анализа проводятся и во многих европейских странах, в том числе там, где отмечается гибель пчелиных семей с признаками коллапса. Например, в Австрии были исследованы образцы пчел более чем 90 пасек. Пробы брали из неблагополучных семей с признаками ослабления, коллапса, паралича пчел и т.д. В большинстве образцов было идентифицировано более одного вируса. Наиболее распространенными оказались вирус деформации крыла (91% образцов), обычный вирус острого паралича (68%) и вирус мешотчатого расплода (49%). В семьях, погибших от внезапного коллапса, наиболее часто удавалось идентифицировать одновременно вирус деформации крыла и обычный вирус острого паралича [2]. Другие европейские исследователи также чаще всего указывают на эти вирусы как на возможную причину потерь пчелиных семей.
Позднее было установлено, что если вирусологические исследования проводить с использованием метода ПЦР, то вирус деформации крыла можно обнаружить практически на всех пасеках США.
Во Франции были проведены аналогичные исследования образцов пчел с пасек, понесших большие потери в зимний сезон 2007/08 г. В образцах был идентифицирован израильский вирус острого паралича, но он не был доминирующим (всего 14%), тогда как обычный вирус острого паралича был установлен в 40% образцов.
Исследование молекулярно-генетических особенностей вирусов выявило, что по первичной структуре некоторых маркерных областей генома израильский вирус острого паралича наиболее близок Кашмир-вирусу пчел и обычному вирусу острого паралича. Поэтому на первых этапах исследований некоторые специалисты, использовавшие праймеры, которые не специфичны для этих вирусов (то есть подобраны к одинаковым участкам геномов этих вирусов), делали неправильные выводы о наличии того или иного вируса в исследуемом материале. Особенно большая путаница возникла между Кашмир-вирусом и израильским вирусом острого паралича.
Было показано, что некоторые участки генома израильского вируса острого паралича и других вирусов интегрируются в геном пчел. Фрагменты нуклеиновых кислот разных вирусов были обнаружены в геноме пчел приблизительно 30% исследованных популяций. Интеграция вируса в геном хозяина — медоносной пчелы — имеет большое биологическое значение. Организм пчел становится невосприимчивым к израильскому вирусу острого паралича, когда в их геном интегрирован участок генома этого вируса [4].
Недавно было показано, что фрагменты генома израильского вируса острого паралича и, возможно, вируса деформации крыла, интегрированные в геном пчелы, могут быть стабилизированы, становятся наследственным признаком и передаются потомству. Пчела, которая никогда не контактировала непосредственно с вирусом, может быть диагностирована по результатам ПЦР как зараженная, тогда как она унаследовала вирусный сегмент от прародителя [3]. Поэтому для исключения ложноположительных ответов необходимо проведение специальных исследований.
Сообщения об обнаружении некоторых вирусов пчел практически на всех исследуемых пасеках, видимо, могут не соответствовать действительности. Обнаружение с помощью ПЦР участков генома некоторых вирусов совсем необязательно говорит о присутствии непосредственно вирусов и тем более о гибели от них пчел. В некоторых случаях это может, наоборот, служить свидетельством устойчивости данной популяции пчел к данному вирусу.
Таким образом, с помощью методов молекулярно-генетического анализа за последние годы получена масса новой информации по вирусам пчел и поставлено много вопросов, в том числе касающихся интерпретации получаемых результатов. В каких случаях можно считать установленным факт гибели пчел от вируса? В каких это всего лишь вирусоносительство, а причины гибели пчел иные? В каких случаях вируса вообще нет, а есть лишь фрагменты вирусной генетической информации, встроенные в геном пчелы?
Нами было проведено исследование патологического материала (погибших пчел и личинок) с пасек страны с помощью метода ПЦР с обратной транскрипцией и сопоставление полученных данных с результатами реакции иммунодиффузии. Мы провели идентификацию вирусов мешотчатого расплода, обычного острого паралича и деформации крыла. Для идентификации методом ПЦР вируса мешотчатого расплода использовали личинок, погибших от этого вируса.
Личинки, отобранные из больной семьи пчел (Московская обл.), содержали большое количество вируса, легко выявляемого в РИД. Для идентификации методом ПЦР вируса острого паралича использовали взрослых пчел, зараженных этим вирусом в лабораторных условиях, а также две пробы погибших куколок из больных семей пчел, доставленных из Краснодарского края и Оренбургской области (наличие вируса острого паралича в них установлено с помощью РИД). Для идентификации вируса деформации крыла использовали пчел из семьи (Московская обл.), в которой ранее этот вирус был выявлен с помощью РИД.
Идентификация вирусов проводилась методом ПЦР с обратной транскрипцией по условиям, описанным ранее Tentcheva et al., [6]; Berenyi et al., [2]. ПЦР-продукты специфического размера были получены для вируса мешотчатого расплода, всех образцов вируса острого паралича и вируса деформации крыла при проведении реакции по условиям [6]. Нам удалось получить ПЦР-продукт специфического размера только для вируса деформации крыла при проведении реакции по условиям [2].
Определение последовательности нуклеотидов изучаемой области генома вируса деформации крыла и вируса острого паралича и анализ полученных последовательностей выявили гомологию исследуемых последовательностей с последовательностями этих вирусов, размещенных в международной базе данных. Полученные результаты однозначно подтверждают достоверность результатов молекулярно-генетического анализа. Отсутствие продуктов амплификации для образцов, содержащих вирус острого паралича, в случае проведения реакции по условиям [2] требует специального внимания. Известно, что для вирусов характерна вариабельность генома и вполне возможно, что отсутствие положительной реакции связано с распространением на территории России специфических штаммов вируса острого паралича пчел.
Таким образом, использование молекулярно-генетических методов анализа для выявления вирусов пчел, а тем более интерпретация результатов требуют осторожности. Необходимо изучить штаммы вирусов, циркулирующие на территории России на молекулярно-генетическом уровне в сочетании с уже отработанными серологическими методами диагностики. Важно определить у пчел не только наличие генетической информации вирусов, но и присутствие самих вирионов, а также их количественное содержание.
Молекулярно-генетические исследования дадут в будущем возможность оценить распространенность вирусов в популяциях пчел России, в том числе не выявленных ранее вирусов и их разновидностей. Полученные данные заложат основу для понимания и прогнозирования развития ситуации в конкретном регионе в связи с наличием того или иного вируса либо их комбинаций, позволят проводить анализы для нужд практического пчеловодства, оценивать возможность перехода при определенных условиях скрытой инфекции в открытое заболевание с тяжелыми последствиями.
Работа поддержана грантом Президента РФ НШ-4442.2010.4 и грантом подпрограммы «Генофонды и генетическое разнообразие» программы Президиума РАН «Биологическое разнообразие».
Ю.М.БАТУЕВ
ГНУ ВНИИ экспериментальной ветеринарии
им. Я.Р.Коваленко
И.И.ГОРЯЧЕВА
Государственное учреждение
«Институт общей генетики
им. Н.И.Вавилова РАН»
Ключевые слова:
вирусы пчел, варроа, израильский вирус острого паралича, Кашмир-вирус.
Аннотация:
показаны результаты молекулярно-генетические исследований. Они дадут в будущем возможность оценить распространенность вирусов в популяциях пчел России, в том числе не выявленных ранее вирусов и их разновидностей.
Summary:
shows the results of molecular genetic studies. They will in the future to assess the prevalence of viruses in bee populations in Russia, including those not previously identified viruses and their varieties.
Keywords:
virus of bees, Varroa, an Israeli virus, Kashmir-virus.
Литература:
1. Батуев Ю.М. Новое о вирусе паралича // Пчеловодство. — 1979. — №7. — С. 10–11.
2. Berenyi O., Bakonyi T., Derakhshifar I. et al. Occurrence of Six Honeybee Viruses in Diseased Austrian Apiaries // Applied and Environmental Microbiology. — 2006, vol. 72, 4, 2414–2420.
3. Maori E., Mozes-Koch R., Sela I. Integration of viral sequences into the bee genome: how to distinguish between viral infection and expression of integrated sequences // COLOSS Work Shop New Molecular Tools — Bern, Switzerland, 12-21 May 2009, p. 20.
4. Maori E., Tanne E., Sela I. Reciprocal sequence exchange between nonretro viruses and hosts leading to the appearance of new host phenotypes //Virology, 2007, 362(2), 342–349.
5. Palacios G., Hui J., Quan P.L. Genetic Analysis of Israel Acute Paralysis Virus: Distinct Clusters are Circulating in the United States // Journal of Virology, 2008, Vol. 82, No. 13, p. 6209–6217.
6. Tentcheva D., Gauthier L., Zappulla N. et al. Prevalence and Seasonal Variations of Six Bee Viruses in Apis mellifera L. and Varroa destructor Mite Populations in France // Applied and Environmental Microbiology. — 2004, 70, 12, p. 7185–7191.
Адрес редакции журнала "Пчеловодство":
