В растениях могут быть встроенные генами участки, кодирующие белки-ингибиторы протеиназ, которые подавляют протеолитические ферменты пищеварительного тракта. В результате этого вредители не в состоянии переваривать белки и погибают от голодания. Ингибиторы протеиназ могут быть изолированы из растений, животных и насекомых. Они воздействуют на специфические протеиназы: цистеин- и серин-протеазы — или обладают двойным действием. У пчел преобладают серин-протеазы. При потреблении 25% белка с пыльцой пчела получает от 0,04 до 4% ингибитора протеаз из трансгенного растения. Данные по содержанию этой группы трансгенов в пыльце и нектаре отсутствуют.
Очищенный соевый ингибитор трипсина Bowman-Birk (BBI) испытывался в основном на старых, фуражирующих пчелах.
Концентрация 1,0; 0,1; 0,01 и 0,001 мг/мл сахарного сиропа не влияла на продолжительность жизни 7- и 15-дневных пчел при наблюдении в течение 4 сут (96 ч); при длительном наблюдении концентрация 1 и 0,1 мг/мл сиропа приводила к увеличению смертности, снижению активности трипсина и химотрипсина в кишечнике, изменяла рефлекс вытягивания хоботка пчелой на корм, снижала способность пчел к сбору нектара. Потеря рефлекса сохранялась в течение 13 дней у 15-дневных пчел после скармливания им 26 мкг/мл корма, а при концентрации 1 мг/мл рефлекса не было 15 дней (L.Jouanin et al., 1998; J.A.Malone, M-H.Pham Delegue, 2001; и др.).
В лабораторных опытах при концентрации 1%-ного соевого ингибитора трипсина Kunitz (SBTJ) увеличивалась гибель личинок пчел, снижалось развитие их и выходящих из ячеек пчел (H.F.Brodsgaard et al., 2001, 2003). При содержании в 1 мл сахарного сиропа 10; 5 или 1 мг исследуемого ингибитора наблюдалась ускоренная гибель молодых пчел, снижалась активность эндопептидаз (трипсин, химотрипсин, эластаза) кишечника; экзапептидаза (лейцин-аминопептидаза) достоверно возрастала при всех скармливаемых концентрациях.
Концентрация ингибитора 0,1 и 0,01 мг/мл сахарного сиропа охотно потреблялась пчелами, при кратковременном наблюдении продолжительность их жизни не изменялась. Но со временем, при концентрации 0,1 мг/мл, их жизнь сокращалась за счет компенсаторного восстановления протеиназ средней кишки в результате использования аминокислот белков тела пчелы. 0,1 и 1% SBTJ за 10 дней достоверно снижали среднюю массу и диаметр долек гипофарингиальных желез рабочих пчел (D.Babendreier, 2003; D.Babendreier et al., 2005, 2005a). При высоких дозах (10 мг/г пыльцы) отмечен низкий поведенческий рефлекс на корм. Ингибитор снижал продолжительность жизни шмелей, подавлял эластазоподобную активность и химотрипсин, снижал уровень трипсина кишечника, но лейцин-аминопептидаза не изменялся (L.A.Malone et al., 2001; L.A.Malone, M.H.Pham-Delegue, 2001).
Ингибитор трипсина из коровьего гороха Vigna sinensis (CpTJ) при скармливании 11 мкг на 1 пчелу и инъекции 0,5 мкг на 1 пчелу не влиял на выживание в течение 24 и 48 ч 10-дневных пчел. При дозах 1; 5 и 10 мкг/мл сахарного сиропа обонятельный рефлекс пчел снижался (L.A.Malone, M-H.Pham-Delegue, 2001).
Ингибиторы протеиназы 1 и 2 из томатов (РОТ-1 и РОТ-2) в концентрациях 2 мг/г пыльцы и 0,1 мг/мл сиропа не влияют на продолжительность жизни при кратковременном наблюдении. 2 мг/мл сиропа и 10 мг/г пыльцы РОТ-1 снижал активность трипсина и химотрипсина в средней кишке, но не изменял эластазу на 8-й день после скармливания молодым пчелам, в пыльце препарат действовал сильнее, чем в сиропе.
РОТ-2 достоверно снижал все эндопептидазы на 3-й и 8-й день независимо от дозы и корма.
Испытания в облетнике на пяти сортах генно-модифицированного (OC-I) масличного рапса и нормального рапса показали отсутствие различий в посещении пчелами культур, продолжительности визита, среднего времени, затрачиваемого пчелой на цветок (L.A.Malone, M-H.Pham-Delegue, 2001).
Следовательно, находящиеся в трансгенных растениях некоторые ингибиторы протеиназы в испытываемых концентрациях были опасны для пчел. Необходимы дальнейшее их изучение, определение концентрации трансгенов в различных частях растений, полевые опыты с пчелами.
Влияние других синтезируемых трансгенными растениями белков на пчел изучено еще слабо. Гены, кодирующие хитиноразрушающие энзимы (хитиназа), изолированы из растений, насекомых и энтомопатогенных микроорганизмов. Хитин является важным компонентом насекомых и грибов.
При скармливании 10-дневным пчелам в течение суток 11 мкг хитиназы и инъекции 1,6–9 мкг на 1 пчелу насекомые жили в течение 24 и 48 ч. Пчелы, получавшие хитиназу из расчета 1; 5 и 10 мкг/мл в сахарном сиропе, сохраняли рефлекс вытягивания хоботка на корм. В облетнике они одинаково брали чистый сахарный сироп и сироп с добавлением 1,3 мг/мл хитиназы, но число посещений при разведении хитиназы в 100 и 1000 раз было в 4 раза ниже, хотя различий в массе собранного продукта не установлено.
На трансгенном масличном рапсе число посещений, время пребывания на цветке и количество собранного нектара не отличались от контрольных растений. К сожалению, отсутствуют данные влияния хитиназы на расплод пчел, где отрицательный эффект наиболее вероятен.
Потенциальным трансгенным продуктом против насекомых — вредителей растений может быть биотин — связанные белки, из которых известны авидин из цыплят и стрептовидин из бактерий. Пыльца естественных растений содержит 0,16–2,4 мкмоля этого витамина; перга — 1,83 мкмоля. Скармливание пчелам 6; 7; 11,2 или 20 мкг авидина с пыльцой не влияло на потребление корма, продолжительность их жизни, средний диаметр и массу гипофарингиальных желез, содержание белка в теле. Личинки, получавшие в первые два дня 164 мкг авидина в 1 мг пыльцы, а в дальнейшем 880 мкг/мг, выживали и развивались нормально (L.A.Malone, M-H.Pham-Delegue, 2001; L.A.Malone et al., 2002, 2004).
Для борьбы с сорняками в трансгенные растения вводится ген, кодирующий белок глюфозинат-энзим, разлагающий гербициды. Трансгенный гербицид — устойчивый масличный рапс не влиял на смертность рабочих пчел, активность фуражирования, предпочтительность растений, состояние семей пчел (N.Chaline et al., 1999). К перспективным также относятся гены, кодирующие лектины и яды пауков (L.A.Malone, M-H.Pham-Delegue, 2001).
В связи с трансгенными растениями остро встает вопрос о продуктах пчеловодства. Согласно регламенту ЕС 49/2000 продукты питания, содержащие менее 1% генно-модифицированных компонентов, не маркируются. Мед, по мнению S.Bogdanov et al. (2003), содержит 0,1% пыльцы и потому не требует специальных исследований на наличие трансгенного продукта. Однако при этом не учитывается возможность попадания их из нектара. Вместе с тем исследования, проведенные в Германии, показали, что трансгенные продукты могут попадать в мед и иным путем. При изучении 10 образцов шести марок специально готовящихся подкормок для пчел, куда в качестве источника белка добавляли соевую муку, в продуктах (5 образцов) выявлены генно-измененные материалы в пределах допустимых норм (менее 1%). Микроскопия центрифужных осадков 389 проб меда показала наличие в 23 пробах (5,9%) характерных для соевых бобов фрагментов в виде рыбных чешуек. В результате дальнейших исследований 19 проб меда в 11 установлен трансгенный материал (R.Siede et al., 2005). Неизвестно влияние трансгенных продуктов на степень зрелости цветочного меда, его показатели инвертазы, диастазы (амилазы), сахаров; нет данных по падевым медам. Безусловному исследованию на наличие трансгенов должны подвергаться заготовляемые пыльца и перга, используемые в медицине, а также для подкормки пчел, шмелей, изготовления для них кормов. Совершенно не изучены попадание трансгенных продуктов в прополис, маточное молочко и их влияние на пчелиный яд и воск. Мировой опыт показывает, что крестьянские хозяйства нередко высевают семена фуражного трансгенного зерна (кукуруза), не предназначенного для использования в продуктах питания.
6 сентября 2011 г. Верховный суд Европейского союза (ЕС) в Люксембурге постановлением С-442/09 запретил сбыт в ЕС меда без предварительного проведения анализов на отсутствие в нем пыльцы ГМО и без соответствующей маркировки готовой продукции. Такое решение было принято в связи с иском баварского пчеловода, пасека которого располагалась по соседству с посевами генно-модифицированной кукурузы, и мед оказался загрязненным пыльцой этой культуры. Предполагается, что это постановление позволит европейским пчеловодам в дальнейшем предъявлять иски к производителям ГМО.
Определение действия трансгенных растений на пчел и других насекомых-опылителей строится на данных лабораторных опытов с чистым трансгенным продуктом. Характер опытов зависит от природы трансгена и его действия. Основным объектом исследования является пыльца, хотя необходимы также данные по нектару, секретам (смолы, камедь) растений, выделениям афид, используемым пчелами при сборе пади. Важно знать распределение трансгена в этих продуктах, что позволяет ориентироваться в выбранных дозах. Следует учитывать особенности потребления и пищеварения насекомых. Пыльца необходима личинкам пчел с 3-дневного возраста, потребление ее идет в возрастающем объеме до момента запечатывания ячейки сота. Этот продукт важен для молодых взрослых пчел для развития и функционирования их желез, в том числе гипофарингиальных, секретом которых они выкармливают молодых личинок и матку. Выделяемые железами инвертаза и амилаза используются пчелами для переработки нектара в мед. От своевременного поступления полноценной пыльцы в улей зависят функционирование восковых желез и воскостроительная деятельность пчел. Поступающие в организм молодых пчел белки важны для построения защитных белков гемолимфы (лизоцим, апидицины и др.), жирового тела, определяющего длительность жизни. С переходом пчел к летной деятельности насекомые используют уже накопленные белки и потребление пыльцы практически прекращается, однако начало яйцекладки маткой весной зависит от хранящихся запасов перги в улье. Шмели питаются пыльцой в течение всей жизни.
Единая разработанная методика по исследованию влияния трансгенных растений на пчел (шмелей) отсутствует. Имеющиеся экспериментальные данные и наблюдения по влиянию трансгенов на пчел отрывочны и неполны. Отсутствуют сведения по длительному воздействию сублетальных доз трансгенных продуктов на подготовку и способность к зимовке семей пчел и последующему развитию, их влияние на клеточные и гуморальные факторы иммунитета у пчел, воздействия на матку и трутней.
Одним из открытых вопросов остается влияние трансгенных растений на микрофлору. Так, одно растение кукурузы дает в среднем 1 г пыльцы, за вегетацию на 1 га почвы будет попадать 6 г Bt-токсина (О.А.Монастырский, 2002), который контактирует с бактериями почвы. Исследования кишечной флоры людей, получавших модифицированную сою, показали, что одна из 3 тыс. бактериальных клеток включает трансгенный продукт (О.А.Разбаш и др., 2002). Источником патогенных для пчел спироплазм являются цветки растений, с листьев растений выделен возбудитель американского гнильца. Многих патогенов пчел в неблагополучных семьях этих насекомых устанавливают в находящихся в ульях перге и меде. Влияние трансгенных продуктов на них неясно.
Среди незапланированных эффектов трансгенов при вставке геномов энтомопатогенных вирусов в растения указывается на возможность возникновения новых патогенов, в том числе опасных для полезных насекомых (О.А.Разбаш и др., 2002).
Возможность возникновения плейотропных эффектов в трансгенных растениях, распространение трансформированных генов в природе вызывают необходимость создания специальной службы слежения. Таков далеко не полный перечень проблем, подлежащих изучению в XXI веке.
О.Ф.ГРОБОВ, А.Н.СОТНИКОВ
ВИЭВ
Р.Т.КЛОЧКО, С.Н.ЛУГАНСКИЙ
ВНИИВСГЭ
Адрес редакции журнала "Пчеловодство":
