Нозематоз — опасное заболевание медоносной пчелы, широко распространенное во всем мире и периодически вызывающее массовую гибель пчел и пчелиных семей на пасеках (Гробов и др., 1987; Bourgeois et al., 2009). Возбудитель нозематоза медоносных пчел микроспоридия Nosema apis был описан 100 лет назад (Zander, 1909) и до последнего времени считался единственным специфическим паразитом медоносной пчелы Apis mellifera.
В 1997 г. был описан новый возбудитель нозематоза — Nosema ceranae, выделенный из дальневосточной пчелы Apis cerana, который в последнее десятилетие регистрируется в пробах медоносной пчелы, собранных с большинства континентов (Klee et al., 2007).
Патогенное воздействие на пчел у N. ceranae выражено значительно сильнее по сравнению с N. apis, хотя классическими методами микроскопической диагностики паразиты этих двух видов плохо различимы и требуют анализа тонкой морфологии или нуклеотидных последовательностей рДНК (Bourgeois et al., 2009). По некоторым данным, возможно заражение медоносной пчелы и паразитом шмелей — Nosema bombi, вызывающим диссеминированный микроспоридиоз, а также другими формами микроспоридий, видовая принадлежность которых не определена — Nosema sp. и Microsporidium sp. (Гробов и др., 1987). Филогенетический анализ, основанный на анализе нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующих рибосомальную РНК (рДНК), предполагает происхождение обоих видов микроспоридий — специфических паразитов пчел — от паразита шмелей (Shafer et al., 2009).
В настоящее время за рубежом рутинное определение видов возбудителей нозематоза пчел проводится на основе секвенирования или видоспецифической амплификации участков рДНК микроспоридий. В России нозематоз диагностируют только микроскопическим методом, при котором невозможно установить видовой состав возбудителей заболевания. При выявлении ноземаподобных спор методом световой микроскопии патоген обычно определяется как N. apis.
Наш опыт показывает, что на пасеках России пчеловоды выявляют нозематоз по клиническим признакам (весенняя опоношенность гнезда, ослабление семей, гибель матки и др.). Однако предварительный диагноз не всегда подтверждается лабораторными исследованиями, поскольку такие симптомы характерны и для бактериальных кишечных инфекций медоносных пчел. В то же время при латентном течении заболевания или низкой степени поражения возбудителем нозематоза пчел микроскопические исследования их проб не всегда показывают присутствие спор ноземы, что создает угрозу неконтролируемого распространения заболевания между отдельными семьями и пасеками.
Таким образом, применение современных методов молекулярно-биологического анализа необходимо как для видовой идентификации патогенов, так и для повышения чувствительности диагностики нозематозов пчел.
Споры микроспоридий получены следующим образом. В начале июня на частную пасеку (с. Дубровное, Ярковский р-н, Тюменская обл.) завезли пакеты пчел из Пермского края. Семьи из пакетов хорошо развивались, но через три недели началось их резкое ослабление и гибель пчел. Микроскопический анализ показал высокую степень заражения ноземой — 170–200 спор в поле зрения (что соответствует около 400 млн спор на пчелу). Развитие заболевания могло быть связано как с интродукцией возбудителя из Пермского края, так и с восприимчивостью завезенных пчел к местным (тюменским) изолятам патогена. В связи с такой неопределенностью географического происхождения полученный изолят обозначен нами как «тюменский», по месту его выделения.
Споры, выделенные из погибших пчел, скармливали с сахарным сиропом с целью массовой их наработки для молекулярно-биологического анализа. Затем споры выделяли методом гомогенизации и осаждения.
Для определения пригодности условий хранения образцов пчел для их ПЦР-анализа водную суспензию спор разделили на аликвоты по 100 мкл. В каждом варианте хранения использовали две повторности. Варианты консервации спор были следующими: водная суспензия, 8°С; водная суспензия, –20°С; суспензия в 50%-ном глицерине, –20°С; водная суспензия, –80°С; споры, высушенные и хранившиеся при комнатной температуре; фиксация 70°-ным и 90°-ным этанолом при комнатной температуре. Все образцы хранили в указанных условиях в течение месяца.
Для экстракции геномной ДНК образцы инкубировали 3 ч при 65°С в лизирующем буфере, содержащем цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ), протеиназу К и b-меркаптоэтанол с последующей очисткой смесью фенола и хлороформа и осаждением изопропанолом (Sambrook et al., 1989). Этот метод более трудоемок, чем современные коммерческие наборы для выделения нуклеиновых кислот, но зато он дает бóльший выход геномной ДНК, что принципиально важно при ее низком содержании в образце (Stone et al., 2004).
Для проведения полимеразной цепной реакции использовали стандартные условия, подобранные ранее (Игнатьева и др., 2008; Токарев и др., 2009). В качестве маркеров участков ДНК, кодирующих рибосомальную РНК, использовали праймеры, рекомендованные для большинства микроспоридий и показавшие свою эффективность для диагностики ряда микроспоридий насекомых (Weiss, Vossbrinck, 1999).
Для оценки результатов ПЦР продукты реакции разделяли методом электрофореза в агарозном геле с добавлением бромистого этидия, который связывается с молекулами нуклеиновых кислот и дает флюоресцентное свечение под действием ультрафиолета. Положительный сигнал, то есть окрашенные полосы определенного размера, наблюдали при широком диапазоне температуры отжига праймеров, что свидетельствует о воспроизводимости результатов ПЦР-диагностики при варьировании условий ее проведения. При этом использование пары праймеров V1f:530r позволяло наблюдать положительный сигнал в варианте разведения образца, соответствующего количеству ДНК, выделенному из 10–15 спор. Такая высокая чувствительность диагностики воспроизводилась по отношению ко всем вариантам хранения образцов спор микроспоридий, включая высушивание и замораживание. Следовательно, апробированные условия хранения образцов микроспоридий не влияют на эффективность последующей ПЦР-диагностики, что, очевидно, обусловлено высокой стабильностью структуры молекул ДНК (Stone et al., 2004).
Для определения видовой принадлежности выявленного паразита специфический фрагмент ДНК, амплифицированный в результате ПЦР, был выделен из агарозного геля методом сорбирования на силикагеле и секвенирован на автоматическом секвенаторе. Полученная нуклеотидная последовательность (сиквенс) из 411 нуклеотидов была отредактирована в приложении BioEdit (Hall, 1999) и сопоставлена с сиквенсами рибосомальной ДНК микроспоридий, доступными в генбанке на сервере NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Сходство нуклеотидных последовательностей тюменского изолята микроспоридий и различных изолятов N. apis составило 99,7–100%. Уровень сходства полученного сиквенса с сиквенсами рДНК N. bombi и N. ceranae был значительно ниже (90,2 и 87,7% соответственно), что позволяет однозначно идентифицировать тюменскую микроспоридию как N. apis. При этом у тюменского изолята наблюдалось 100%-ное сходство данного участка рДНК с изолятом N. apis из Новой Зеландии и отличие на один нуклеотид в положении 45 от изолятов из Испании, Швеции и США. У перечисленных изолятов N. apis, представленных в генбанке, участки рДНК не имеют иных различий в области, кодирующей рРНК малой субъединицы. Для дальнейших филогеографических исследований (то есть анализа эволюционных связей между географическими изолятами) необходимо секвенирование межгенного транскрибируемого спейсера (ITS) и рДНК большой субъединицы (Rice, 2001), что требует применения других наборов праймеров (Weiss, Vossbrinck, 1999).
ПЦР может быть рекомендован как быстрый, надежный и высокоэффективный метод диагностики нозематоза медоносной пчелы. Наличие в свободном доступе информации о нуклеотидных последовательностях ДНК микроспоридий различных видов, паразитирующих в пчелиных, дает возможность разработки видоспецифичных праймеров, которые в дальнейшем позволят проводить видовую идентификацию патогенов на основе ПЦР без обращения к более трудоемким и дорогостоящим методам секвенирования.
Исследования поддержаны грантом РФФИ №07-04-00269 и грантом Президента РФ № МК-3419.2009.4.
Ю.С.ТОКАРЕВ, А.Н.ИГНАТЬЕВА
З.Я.ЗИНАТУЛЛИНА
Всероссийский НИИ защиты растений РАСХН,
Всероссийский НИИ ветеринарной энтомологии
и арахнологии СО РАСХН
Ключевые слова:
нозематоз, микроспоридии, ПЦР-диагностика, рДНК.
Аннотация:
анализ нуклеотидной последовательности участка рибосомальной ДНК позволил идентифицировать вид возбудителя заболевания как Nosema apis. ПЦР может быть рекомендован как быстрый, надежный и высокоэффективный метод диагностики микроспоридий медоносной пчелы.
Summary:
analysis of the nucleotide sequence of the site of ribosomal DNA allowed to identify the type of pathogen diseases such as Nosema apis. PCR can be recommended as a fast, reliable and highly effective method for diagnosis of microsporidia honeybee.
Keywords:
nosema, microsporidia, PCR diagnostics, rDNA.
Литература:
1. Гробов О.Ф., Смирнов А.М., Попов Е.Т. Болезни и вредители медоносных пчел: справочник. — М.: Агропромиздат, 1987.
2. Игнатьева А.Н., Токарев Ю.С., Горбунов П.С. Молекулярная диагностика микроспоридии Nosema sp. (Microsporidia, Nosematidae) — паразита медоносной пчелы Apis mellifera L. // Науч. тр. каф. зоол. РГПУ. — 2008. — №8. — С. 50–54.
3. Bourgeois A.L., Rinderer T.E., Beaman L.D., Danka R.G. Genetic detection and quantification of Nosema apis and N. ceranae in the honey bee // J. Invertebr. Pathol. — 2009. — in press.
4. Shafer A.B., Williams G.R., Shutler D., Rogers R.E., Stewart D.T. Cophylogeny of Nosema (Microsporidia: Nosematidae) and bees (Hymenoptera: Apidae) suggests both cospeciation and a host-switch. J. Parasitol. — 2009. — Vol. 95. — P. 198–203.
5. Zander E. Tierische Parasiten als Krankheitserreger bei der Biene // Leipziger Bienenztg. – 1909. — Vol. 24. — P. 147–150.
Адрес редакции журнала "Пчеловодство":
