Мешотчатый расплод — одна из распространенных вирусных болезней пчел, которая регистрируется на всех континентах (M.Aubert, B.Ball et al., 2008). Сведения по мешотчатому расплоду в СССР были известны еще в первой половине прошлого века. По результатам исследований патологического материала, поступающего во ВНИИ экспериментальной ветеринарии, вирус мешотчатого расплода является наиболее частой причиной гибели пчелиного расплода на пасеках многих регионов, в том числе крупных пчелоразведенческих хозяйств («Пчеловодство» 2010, №10). В настоящей работе приведены новые сведения о клинических признаках болезни и новые данные по генетическим особенностям ее возбудителя.
В справочниках по болезням пчел обычно приводят классические признаки мешотчатого расплода, то есть погибшие личинки пчел в виде мешочков, заполненных жидкостью. Однако обнаружить таких личинок можно только в случае тяжелого протекания болезни. Часто в семьях пчел, неблагополучных по мешотчатому расплоду, найти больных и погибших личинок почти невозможно. Пчелы безошибочно обнаруживают их и оперативно удаляют из улья.
Специалист по болезням пчел L.Bailey (Англия) проводил эксперименты по инкубации печатного расплода в термостате при отсутствии взрослых пчел. Был использован расплод из разных семей пасеки, неблагополучной по мешотчатому расплоду. Установлено, что до 6% личинок могут погибать от этого вируса даже в семьях, которые казались абсолютно здоровыми. Таким образом, при невысокой степени поражения болезнь может оставаться незамеченной.
Известно, что кроме личинок рабочих пчел вирус поражает личинок трутней. Нами отмечено, что пчелы менее оперативно удаляют погибших личинок трутней (видимо, из-за более тяжелого веса), а погибших куколок трутней часто разгрызают и выбрасывают по частям. Гибель личинок рабочих особей и трутней происходит после их запечатывания. Пчелы распознают ячейки с погибшими личинками и вскрывают их.
В норме открытые личинки лежат колечком на дне ячейки. Только после запечатывания они вытягиваются и начинают прясть кокон. Вытянувшиеся личинки в открытых ячейках указывают на патологию (рис. 1).
У пчеловодов выбрасывание личинок и куколок трутней обычно не вызывает особой тревоги. Однако в разгар сезона выбрасывание трутневого расплода указывает на болезнь. Скорее всего, то же самое происходит и с личинками рабочих особей, но менее заметно.
Иногда личинки, зараженные вирусом мешотчатого расплода, не погибают на стадии прядения кокона, переходят в стадию предкуколки и долго остаются живыми. У них не накапливается жидкость под личиночной кутикулой. Внешне они выглядят нормально и на первый взгляд непонятно, почему пчелы вскрывают их ячейки. Однако у некоторых предкуколок сквозь личиночную кутикулу можно увидеть пигментированные глаза (рис. 2). В норме у личинок нет органов зрения. Зачатки конечностей и глаза появляются у предкуколок под личиночной кутикулой, но они белые. Даже после завершения стадии предкуколки, сбрасывания личиночной кутикулы и образования куколки ее тело некоторое время лишено пигментации. В доступной литературе мы не нашли сведений о том, что на стадии предкуколки может происходить пигментация глаз.
Для выявления в личинках и предкуколках вируса мешотчатого расплода использовали реакцию иммунодиффузии (РИД). Эта серологическая реакция для идентификации вирусов пчел была впервые использована L.Bailey. Результаты нашей работы показали, что предкуколки с пигментированными глазами содержат вирус в большом количестве. Следовательно, вирус мешотчатого расплода даже при интенсивном размножении в некоторых случаях не затрагивает жизненно важных органов. Предкуколка долго остается живой, но ее метаморфоз нарушается.
В вышеприведенном примере практически все органы (кроме глаз) прекращают свое развитие. В других случаях куколка все же образуется, но с явными уродствами (нарушены пропорции между головой, грудью и брюшком, отсутствуют конечности). Куколка, пораженная вирусом, может не иметь никаких внешних дефектов. Таким образом, вирус мешотчатого расплода вызывает гибель не только личинок старшего возраста, но и предкуколок и куколок. Пчелы старше 8 дней невосприимчивы к вирусу мешотчатого расплода. Более молодые пчелы могут заражаться, и тогда они становятся вирусоносителями, какие-либо видимые симптомы болезни у них отсутствуют, но нарушается функция сбора пыльцы и сокращается продолжительность жизни.
В 1960–1970-е гг. L.Bailey с помощью РИД исследовал большое число образцов личинок европейской пчелы A. mellifera, собранных в разных странах, и не выявил серологических различий между обнаруженными в них изолятами вируса мешотчатого расплода. Вирус с небольшими отличиями физико-химических и серологических свойств был выделен L.Bailey et al. в 1982 г. от погибших личинок азиатской пчелы Apis cerana, привезенных из Таиланда, и назван тайским вирусом мешотчатого расплода. В тот период тайский вирус мешотчатого расплода был широко распространен в семьях A. cerana в Таиланде, Бирме, Индии и Непале, где вызывал массовую гибель пчелиных семей до 90–95%.
Ареалы европейских и азиатских пчел на протяжении многих тысяч лет не совпадали. Массовый завоз европейских пчел в ареал азиатских произошел в прошлом веке. По отдельным сведениям, первые случаи интродукции пчел датируются более ранним периодом. Например, в Японию европейскую пчелу впервые завезли в 1877 г. (Y.Kojima et al., 2011). Пчел этих двух видов местные пчеловоды часто содержали на одних и тех же пасеках, где возможно и произошел переход некоторых возбудителей болезней с одного вида пчел на другой с дальнейшей адаптацией к новому хозяину. С вирусом мешотчатого расплода этого не произошло. В лабораторных условиях L.Bailey удалось заразить куколок европейской пчелы вирусом тайского мешотчатого расплода. Однако в естественных условиях для этого вируса, скорее всего, существует видовой барьер (Y.Kojima et al., 2011; Se-Eun Choe et al., 2011): у каждого вида пчел циркулирует только свой вирус.
По данным филогенетических исследований области РНК-полимеразы вирусов мешотчатого расплода, изолированных в разных географических местах и от разных видов пчел, выделяют три генотипа: южноафриканский, европейский и азиатский (* Термин предложен Se-Eun Choe et al. (2011) вместо использованного ранее «дальневосточный генотип» Grabensteiner et al., 2001) [3].
Что представляют собой штаммы вируса мешотчатого расплода, циркулирующие среди пчел на территории России, до недавнего времени оставалось неизвестным. Это и побудило нас провести исследования на молекулярно-генетическом уровне материала, в котором ранее методом РИД установили вирус мешотчатого расплода. Материал был собран в разные годы на пасеках Краснодарского края (район Кисловодска), Республики Адыгея (Майкоп), Калужской, Оренбургской, Архангельской и Московской областей (в том числе от семей пчел, завезенных из Узбекистана) и хранился в замороженном или лиофилизированном виде. Исследовали также лабораторный штамм Tr5 вируса мешотчатого расплода, культивируемый на куколках пчел и трутней методом микроинъекции. Идентификацию вируса проводили методами РИД и ПЦР (полимеразная цепная реакция). В РИД использовали сыворотки собственного производства, которые были получены иммунизацией кроликов вирионами, выделенными из погибших личинок с клиническими признаками мешотчатого расплода из Калужской области (сыворотка №6), и вирионами, выделенными из погибших пчел с деформированными крыльями из Таджикистана (сыворотка №58).
Образцы сывороток были отправлены в Великобританию (Rothamsted Experimental Station, Harpenden, Hertfordshire, UK), где их тестировала доктор Brenda V. Ball в РИД с разными вирусами пчел. Сыворотка №6 давала положительный результат только с эталонным штаммом Rothamstead вируса мешотчатого расплода (* Структура полного генома приведена в Genbank (AF092924). Штамм имеет европейский генотип) (титр антител 1:128). Сыворотка №58 не реагировала с этим штаммом, но реагировала с вирусом деформации крыльев (титр антител 1:64).
В ПЦР материал исследовали со специфическими праймерами к вирусам мешотчатого расплода (Tentcheva, 2004; Grabensteiner, 2001), деформации крыльев (Maori, 2007; Berenyi, 2006), острого паралича (Tentcheva, 2004), Кашмир (Stoltz et al.,1995; Maori, 2007), черных маточников (Maori, 2007).
Во всех исследованных образцах подтверждено наличие вируса мешотчатого расплода. В двух пробах выявили присутствие одновременно двух вирусов: мешотчатого расплода и деформации крыльев. Никакие другие вирусы из вышеперечисленных в исследованных пробах не обнаружили.
Для трех изолятов и лабораторного штамма вируса мешотчатого расплода была определена первичная структура фрагмента РНК-полимеразы (последовательности зарегистрированы в Международной базе данных GenBank под номерами JN83572—JN83575) и проведен филогенетический анализ. На филограмме (рис. 3) можно выделить четыре группы, или генотипа, из которых группы 1–3 были впервые описаны Grabensteiner et al. (2001). Европейский генотип (группа 1) с эталонным штаммом из Великобритании объединяет вирусы Центральной Европы (Германия, Франция, Австрия, Венгрия, Испания) и Великобритании. В этой же группе вирусов оказались изоляты 207/4 и 212/3, выделенные в России (Московская обл. и Кисловодск соответственно), гомология между которыми составляет 99%. Ближайшие их родственники присутствуют в Германии и Франции.
К азиатскому генотипу (группа 2) принадлежат вирусы из Южной Кореи, Китая, Непала, Индии и Японии. Среди них находится и тайский вирус мешотчатого расплода. Южноафриканский генотип (группа 3) представлен одним изолятом из Южной Африки.
На обособленной ветви (группа 4) оказались два наших изолята: лабораторный штамм Tr5 и изолят 202/8, выделенный из семьи пчел, завезенной из Узбекистана. Гомология между ними составляет 94,2%, в то время как с представителями других групп она не превышает 80,6–83,5%.
Генетическое расстояние в пределах одной группы колеблется от 1% (группа 2) до 6% (группы 1 и 4), а между группами от 10% (группы 1 и 2) до 25–28% (группы 3 и 4). На этом основании группа 4 может быть выделена в самостоятельный генотип.
Исследуемые в настоящей работе изоляты генетических групп 1 и 4 вируса мешотчатого расплода по-разному вели себя в РИД с сыворотками № 6 и 58. Все изоляты геногрупп 1 и 4 положительно реагировали с сывороткой №6, подобно эталонному штамму Rothamstead (Великобритания) вируса мешотчатого расплода европейского генотипа. C сывороткой №58 положительно реагировали только изоляты геногруппы 4 вируса мешотчатого расплода и изоляты вируса деформации крыльев. В перекрестной реакции между вирусом мешотчатого расплода геногруппы 4 и вирусом деформации крыльев серологического родства не выявлено. Таким образом, в наших экспериментах было установлено, что сыворотка №58 содержит антитела не только к вирусу деформации крыльев в титре 1:64, но и к вирусу мешотчатого расплода генотипа 4 в титре 1:8. С вирусом мешотчатого расплода европейского генотипа (группа 1) реакция отсутствовала, что согласуется с данными B.V.Ball. По всей видимости, материал из Таджикистана, который использовали для получения сыворотки №58, содержал два морфологически схожих вируса: деформации крыльев и мешотчатого расплода генотипа 4.
На основании проведенных исследований можно сделать вывод о существовании двух генотипов вируса мешотчатого расплода у пчел A. mellifera на территории Российской Федерации. Один из них принадлежит европейской группе. Второй образует самостоятельную группу 4, ранее никем не описанную, занимающую промежуточное положение между вирусами азиатского (группа 2) и южноафриканского (группа 3) генотипов.
Источником вируса мешотчатого расплода генотипа 4 в одном случае была семья пчел из Узбекистана (изолят 202/8), в другом (материал, используемый для иммунизации) — из Таджикистана (сыворотка №58). Тем не менее мы воздерживаемся от присвоения генотипу 4 вируса мешотчатого расплода названия по территориальному признаку (например, среднеазиатский), поскольку слишком мало данных имеется о его распространении. Подробную информацию о материалах и методах наших исследований можно найти в ж-ле «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология» (2012, №3).
Ю.М.БАТУЕВ, Н.Ф.ЛОМАКИНА
ВНИИ экспериментальной ветеринарии
На территории России установлены, по крайней мере, два генотипа вируса мешотчатого расплода пчел: европейский и ранее неизвестный генотип 4, занимающий промежуточное положение между азиатским и южноафриканским генотипом. Приведены новые сведения о клинических признаках болезни.
Ключевые слова: мешотчатый расплод, генотип вируса, клинические признаки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Батуев Ю.М. Мешотчатый расплод // Пчеловодство. — 2010. — №10.
2. Ломакина Н.Ф., Батуев Ю.М. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, — 2012. — №3.
3. Grabensteiner E., Ritter W., Carter M.J. et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. — 2001. — V.8 (1).
Адрес редакции журнала "Пчеловодство":
