Естественный ареал Apis mellifera L. охватывает всю Африку, Европу и Ближний Восток. Отличительная черта вида — значительная внутривидовая дифференциация (Ruttner, 1988). На данный момент общепризнано существование 25 подвидов. На территории Европы известны девять, восемь из которых обитают в Южной и Центральной Европе, и только один подвид, Apis mellifera mellifera L. (темная европейская, темная лесная, она же среднерусская пчела), освоил лесостепную и лесную зоны Северной Европы, что делает его очень ценным для пчеловодства северных стран.
К сожалению, в результате непрерывного ввоза пчел с юга в более северные регионы произошла массовая гибридизация аборигенных пчел. В Германии массовый ввоз A. m. carnica в 40-х годах XIX в. привел почти к полной замене местных пчел A. m. mellifera (Maul, Hahnle, 1994). Аналогичное произошло и на большей части территории скандинавских стран и Британских островов, где сейчас разводят A. m. ligustica и A. m. carnica (Cooper 1986; Dews, Milner 1991; Jensen, 2005). Такая же ситуация сложилась и в России.
Одно из основных условий сохранения генофонда — его четкая идентификация (Daly, 1991), которая тем точнее, чем совершеннее инструмент (метод) ее проведения. Первоначально анализировали только морфометрические признаки. Так, Г.А.Кожевников (1900) сделал промеры длины хоботка пчелы и предложил методику измерения ее хитиновых частей.
Современная морфометрическая классификация A. mellifera основывается на работах G.Goetze (1940), В.В.Алпатова (1948) и F.Ruttner et al. (1978). F.Ruttner (1988, 1992), используя мультивариантный анализ морфометрических признаков, разработал метод отличения A. m. mellifera от других европейских подвидов, однако не смог найти четких морфометрических различий между A. m. iberica и A. m. mellifera. Н.И.Кривцов (1998) в своей работе представил стандарты размеров частей тела для подвида A. m. mellifera, используя которые, можно довольно точно определить подвидовую принадлежность.
Морфометрические стандарты получены и в нашей лаборатории для подвида A. m. mellifera башкирских пчел (Саттаров, Николенко, 2002). Однако выяснилось, что эти методы часто не позволяют точно идентифицировать подвиды из-за сильной зависимости морфометрических характеристик пчел от условий окружающей среды и уровня внутривидовой гибридизации (Guzman-Novoa et al., 1994).
В настоящее время большинство исследователей стало переходить на использование молекулярных маркеров, дающих однозначно интерпретируемые результаты. В 60-х годах прошлого века исследования популяций проводили по данным анализа полиморфизма изоферментов (аллозимов) (Hunter, Market, 1957; Richardson et al., 1986, Behura, 2006). К сожалению, этот метод не получил широкого применения из-за низкого уровня полиморфизма у Hymenoptera (Badino et al.,1982; Sheppard, 1988), и в частности у медоносной пчелы (Sheppard, Berlocher, 1984; Sheppard, 1988). Так, гетерозиготность (H) аллозимов у пчел в среднем равна 0,01 (Pamilo et al., 1978), тогда как у большинства представителей других отрядов насекомых этот показатель в среднем составляет около 0,1 (Lewontin, 1974). Также известно, что из 23 проанализированных ферментных систем полиморфными оказались только две у пчел европейских популяций (Shep-pard, Berlocher, 1984), а из 25 — только три у пчел башкирской популяции A. m. mellifera (Косарев с соавт., 2000).
Разработка полимеразной цепной реакции (PCR) в 80-х годах (Mullis et al., 1994) сделала возможным изучение полиморфизма ДНК и привела к революции в области молекулярной биологии. Основная идея PCR заключается в многократном увеличении (амплификации) определенного фрагмента ДНК с использованием праймеров, ограничивающих этот фрагмент, что позволяет проводить анализ, пользуясь минимальным числом биологического материала. В дальнейшем на основе PCR появилось множество молекулярных методов исследования.
Впервые в пчеловодстве ДНК-маркеры применили при изучении полиморфизма длин фрагментов рестрикции ДНК (RFLP) с использованием эндонуклеаз (рестриктаз). D.R.Smith, W.M.Brown (1988) показали отличие подвида A. m. mellifera от африканизированных пчел в США методом RFLP мтДНК эндонуклеазами BcII, EcoRI, NdeI, XbaI. Недостаток этого метода — необходимость большого количества ДНК. В дальнейшем в различении подвида A. m. mellifera стали использовать модифицированный вариант RFLP, основанный на рестрикции амплифицированных фрагментов ДНК. H.G.Hall, D.R.Smith (1991) на основе RFLP амплифицированных фрагментов генов COI и COII эндонуклеазами EcoRI, HincII, XbaI показали отличия подвида A. m. mellifera от других подвидов в Испании. На основе RFLP амплифицированного фрагмента межгенного локуса COI–COII мтДНК с использованием эндонуклеазы DraI установили отличия подвида A. m. mel-lifera от представителей подвидов других эволюционных ветвей на территории Франции (Franck et al., 1998), Италии (Franck et al., 2000), Норвегии, Швеции, Дании, Шотландии, Англии, Ирландии (Jensen et al., 2005).
Параллельно с методом RFLP ДНК развивался и метод изучения полиморфизма длин амплифицированных фрагментов со случайно выбранными праймерами (RAPD). В методе RAPD используют обычно один праймер, который может амплифицировать фрагменты ДНК из любых локусов генома, то есть этот метод не является сайт-специфичным. Метод RAPD нашел применение в исследованиях генома медоносной пчелы (Чудинов, 1999), проведении генетической паспортизации нескольких подвидов пчел, а также в идентификации подвидов A. m. mellifera и A. m. caucasica на основе праймеров OPA-01 и OPA-04.
Еще один метод идентификации — аллель-специфичная PCR с использованием пары праймеров, ограничивающих амплифицируемый фрагмент. В Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН сотрудники разработали метод быстрой PCR-идентификации подвида A. m. mellifera в Республике Башкортостан на основе полиморфизма межгенного локуса COI–COII мтДНК. В дальнейшем наша лаборатория проводила поиск популяций подвида A. m. mellifera на территории Республики Башкортостан и Пермского края (Южный и Средний Урал) на основе полиморфизма межгенного локуса COI-COII мтДНК (Саттаров, Николенко, 2000; Николенко, Поскряков, 2002). В результате выделили четыре популяции A. m. mellifera (Ильясов, 2005; Ильясов с соавт., 2006).
Методика различения подвидов пчел на основе полиморфизма микросателлитных локусов SSR также основана на аллель-специфичной PCR. Микросателлитные локусы располагаются по всему геному и содержат до 100 тандемных повторов размером 2–10 п. н. Многие тесно связаны с консервативными локусами (Loxdale, Lushai, 1998). В последнее время полиморфизм микросателлитных локусов широко используют во всем мире для различения подвидов пчел. Разработано несколько методов: A.Estoup et al. (1995) на основе полиморфизма 7 микросателлитных локусов (B124, A7, A24, A113, A28, A88, A43) и P.Franck et al. (1998, 2000) на основе полиморфизма 8 микросателлитных локусов — в Европе; P.De La Rua et al. (2002) на основе полиморфизма 8 микросателлитных локусов — в Северо-Восточной Италии; A.Jensen et al. (2005) на основе полиморфизма 11 — в Норвегии, Швеции, Дании, Шотландии, Англии, Ирландии, а также в нашей лаборатории Р.А.Ильясовым (2006) на основе полиморфизма 2 микросателлитных локусов (Ap243, 4a110) на Южном и Среднем Урале на территории Республики Башкортостан и Пермского края.
Секвенирование ДНК, то есть определение ее полной нуклеотидной последовательности, также часто используемый метод идентификации подвидов пчел. J.-M.Cornuet et al. (1991) просеквенировали межгенный локус COI–COII мтДНК пчел и показали отличия A. m. mellifera от других подвидов. После изобретения автоматического секвенатора стало доступным исследование большого числа образцов за сравнительно короткое время. M.C.Arias, W.S.Shep-pard (1996) на основе секвенирования фрагмента гена ND2 мтДНК показали отличия A. m. mellifera от других подвидов пчел в Европе.
В нашей лаборатории Р.А.Ильясов с соавторами (2006) на основе этого метода показали отличия A. m. mellifera от южных подвидов пчел на Урале. Совсем недавно сотрудники консорциума по секвенированию генома пчелы просеквенировали весь геном медоносной пчелы и выделили различия между A. m. mellifera и другими подвидами (Weinstock et al., 2006). Им удалось показать, что подвид A. m. iberica очень сходен с A. m. mellifera и группируется с ним. Такое положение может быть результатом гибридизации предковых форм иберийских пчел, о чем пишут многие исследователи (De La Rua et al., 2002).
Таким образом, существует ряд методов идентификации подвида A. m. mellifera (темной европейской, или темной лесной, или среднерусской пчелы). Как можно заметить, наиболее перспективный на сегодняшний день — метод секвенирования генома, а также методы, основанные на PCR. Наша лаборатория разработала комплекс методов для идентификации генофонда среднерусской пчелы и активно ведет работы по поиску сохранившихся популяций A. m. mellifera на территории всей России и их детальной генетической характеристике.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 06-04-08183-офи и 08-04-97039-р-поволжье-а.
Р.А.ИЛЬЯСОВ, А.В.ПОСКРЯКОВ, А.Г.НИКОЛЕНКО
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН,
450054, г. Уфа, пр. Октября, д. 71
Адрес редакции журнала "Пчеловодство":
