В последние годы в связи с приобретением устойчивости микроорганизмов к лекарственным препаратам, а также с обнаружением остаточных количеств лекарственных веществ в продуктах пчеловодства особое внимание уделяется разработке альтернативных способов борьбы с возбудителями болезней пчел. В качестве такого способа для профилактики, лечения и диагностики гнильцовых болезней пчел еще в 50–60-е годы прошлого века были предложены бактериофаги.
Бактериофаг (от греческого слова «фаго» — пожираю) был открыт в 1917 г. д’Эррелем. Оказалось, что бактерии, которые вызывают у людей и животных ряд болезней, также подвержены гибельным для них заболеваниям, то есть каждый вид бактериофага имеет своего возбудителя.
Бактериофаг был применен в профилактических и лечебных целях при гнильцовых заболеваниях пчел. Он нетоксичен, сохранялся в организме до 7–8 дней, в то время как антибиотики уже через 3–5 дней с момента поступления их в организм личинки или пчелы теряют свою активность, а применение их в больших дозах вызывает гибель насекомых. Кроме того, существует опасность бактерионосительства.
Проведенные в те годы исследования по устойчивости бактериофага к внешним условиям среды показали, что прямые солнечные лучи разрушают его в течение 2–3 дней, а значительная вязкость среды, щелочная или кислая реакция, химические вещества (хинин и его соли) понижают активность или совсем разрушают.
Оптимальное накопление бактериофага происходит при рН 7,6–7,8 и продолжается в течение 3–18 ч при оптимальной температуре 37°С. При понижении температуры до 2°С и повышении выше 48°С накопление его прекращается, и он гибнет.
Бактериофаг энергетически адсорбируется электроотрицательными коллоидами, легко фильтруется через фарфоровые свечи и проходит через легкие коллоидные мембраны, пропускает протеины. Будучи прибавлен к жидкому агару, после застывания последнего диффундирует на его поверхность. Осаждается алкоголем, сернокислым аммонием, а также центрифугированием (А.Я.Шапиро, 1950).
Данные о длительности сохранения активности бактериофага практически отсутствуют. А.П.Пехов (1968) сообщал, что в запаянных ампулах он сохранялся до 15 лет.
Просматривая материалы в лаборатории, мы обнаружили лярвейный бактериофаг, изготовленный Витебским ветеринарным институтом в июне 1971 г. Продукт представлял собой прозрачную светло-желтую жидкость, был запаян в ампулы с указанием на этикетке срока годности — 1 год, при хранении при температуре от 4 до 15°С. Титр 10–10. Лярвейный бактериофаг, обнаруженный нами, находился в неблагоприятных условиях (от –4°С до +50°С) в течение 33 лет.
Мы поставили перед собой задачу определить его жизнеспособность.
В качестве тест-культур использовали аналогичный бактериофагу штамм возбудителя американского гнильца пчел Paеnibacillus subsp. larvae. А также исследовали диапазон его действия на Bac. alvei, Bac. paraalvei, Bac. latеrosporus, Ent. faecаolis, Bac. Coli apis.
В чашки Петри с плотной питательной средой (МПСА, МПА) засевали испытываемые тест-культуры. Культивировали в термостате при 37°С в течение 24–48 ч. Учитывали культурально-морфологические, биохимические свойства выросших культур. Затем наносили каплю бактериофага. Ставили чашки Петри в термостат и держали при 37°С, вели наблюдения в течение 4–12 ч.
Контроль — засев тех же тест-культур на плотные питательные среды без добавления лярвейного бактериофага.
Если на месте нанесения капли бактериофага наблюдался сплошной рост тест-культур — бактериофаг считался неактивным. Если наблюдали множество стерильных пятен с негативными колониями микроба — определяли лизис средней величины. Если рост тест-культур полностью отсутствовал, считали, что бактериофаг обладал сильным лизисом.
Изучая диапазон спектра действия в отношении различных возбудителей, установили, что уже через 6 ч взаимодействия лярвейного бактериофага на выросшую культуру — Paenibacillus subsp larvae — наблюдался лизис средней величины. Были хорошо видны стерильные пятна с островками негативных колоний. Однако через 24 ч начинал появляться вторичный, сплошной рост исходной культуры (Paenibacillus subspeciens larvae).
Лярвейный бактериофаг лизировал в слабой степени Bac. alvei, Bac. paraalvei. Были видны мелкие светлые просветления, но уже через 12 ч появлялся вторичный рост исходных культур.
Наши исследования показали, что лярвейный бактериофаг совершенно неактивен в отношении Bac. latеrosporus, Ent. faeсalis, Bac. Coli apis (табл.).
Биологические свойства тест-культур, подвергшихся воздействию лярвейного бактериофага, отличались от исходных: давали инволюционные формы, теряли способность к газообразованию, аллютинации со специфической сывороткой. Бактериоубивающее действие фага, не сопровождающееся растворением бактерий, — это первая стадия лизиса. Фаг, соединяющийся с бактериальной клеткой, нарушает ее метаболизм и жизнедеятельность. Уцелевшие под действием бактериофага лизорезистентные бактерии, как правило, выделяются в виде R-форм с пониженной вирулентностью. Они легче лизируются при повторных пассажах.
Как показали наши исследования — лярвейный бактериофаг может сохранять свою активность и жизнеспособность более 30 лет при неблагоприятных для него условиях хранения.
И.А.ЛЕОНТЬЕВА
ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт
экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко»
Адрес редакции журнала "Пчеловодство":
